Azay-Mycobactéries
 PROCEDURE

Identification par amplification génique
 MO-BM-002

Rév A
 

 Indice de révision
Nature de la modification
A
Création

 

 

 

 

 

 

Sommaire

 

I - Objet

II - Recommandations générales

III - Méthodologie

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 I - Objet

Cette procédure décrit les techniques d'amplification génique utilisées pour mettre en évidence les mycobactéries.

 

II - Recommandations générales

Nature des prélèvements biologiques testés

Les tests d'amplification ne sont validés par le fabricant que s'ils sont réalisés à partir de prélèvements d'origine respiratoire (crachats, aspirations bronchiques, lavages bronchoalvéolaires, tubages gastriques...).

 

Technique de décontamination-fluidification

Seules les techniques de décontamination-fluidification utilisant l'hydroxyde de sodium (NaOH) ou l'hydroxyde de sodium / N-acétyl L-cystéine (NaOH / NALC) sont validées.

Le lauryl sulfate de sodium et le chlorure de benzalkonium, pouvant être inhibiteurs de l'amplification, ne doivent pas être utilisés.

 

Contrôle du matériel utilisé

- Suivi métrologique des étuves, réfrigérateurs et congélateurs.

- Contrôle des micropipettes.

- Contrôle du laveur de microplaques (AMPLICOR Roche).

 

Précautions d'hygiène et sécurité

Des précautions d'hygiène et sécurité spéciales sont appliquées aux tests d'amplification génique. Elles visent à éviter au maximum la contamination par les acides nucléiques. Elles sont décrites à la procédure PR-HS-002.

 

 

Contrôles de Qualité (cf. PR-CQ-002)

 

III - Méthodologie

 

1 - Déroulement des tests d'amplification génique

2 - Mise en évidence des mycobactéries

 

1 - Déroulement des tests d'amplification génique

Zone "propre" Préparation des tubes d'amplification (reconstitution du mélange réactionnel

ou "mix"et répartition dans les tubes PCR)(ne concerne pas le test Lcx /Abbott)

Zone pré-Amplification Extraction : Préparation des échantillons et des témoins (lavage, lyse, neutralisation). Mise en place des échantillons et des témoins traités dans les tubes d'amplification.

Zone post-Amplification Amplification et détection. Recueil des résultats.

 

2 - Mise en évidence des mycobactéries

Pour mettre en évidence les mycobactéries par amplification génique, trois types de techniques ont été décrites et les kits correspondants commercialisés :

A - Tests Amplicor pour la détection de M. tuberculosis complex et pour la détection de M. avium complex (Roche).

B - Test AMTDT M. tuberculosis complex (Gen Probe / bio Mérieux).

C - Test LCx M. tuberculosis complex (Abbott).

 

 
A - Test d'amplification AMPLICOR

Deux méthodes sont utilisées pour la détection de M. tuberculosis complex :

- Amplicor M. tuberculosis complex :détection manuelle (en microplaques).

- Cobas Amplicor M. tuberculosis complex : détection automatisée (au Cobas).

Une seule méthode est actuellement commercialisée pour l'identification de M. avium complex.

 

1 - Principe

Les tests AMPLICOR sont des tests qualitatifs de diagnostic in vitro qui permettent de déceler la présence de M. tuberculosis dans des échantillons cliniques (cf. recommandations générales).

Le principe de ce test repose sur l'amplification par la Taq polymérase de la partie spécifique du gène de l'ARN 16 S. Les amorces biotinylées permettent le marquage de l'amplicon. Après hybridation à une sonde spécifique, le complexe Amplicon biotinylé-sonde est révélé par une réaction enzymatique. La présence d'un contrôle interne d'amplification permet de déceler la présence d'inhibiteurs.

 

2 - Mode opératoire

Se reférer aux fiches techniques du kit du fabricant jointes en annexes du document.

 

 

B - Test d'amplification AMTDT

1 - Principe

Le principe de ce test repose sur l'amplification d'une cible d'ARN ribosomal par la reverse transcriptase. Le DNA complémentaire est ensuite transcrit en RNA par la RNA polymérase. Cet amplicon est hybridé à une sonde ADN conjuguée à un marqueur chimioluminescent. Le signal lumineux émis par les hybrides ARN-ADN est mesuré à l'aide d'un luminomètre.

 

2 - Mode opératoire

Se reférer à la fiche technique du kit du fabricant jointe en annexes du document.

 

C - Test d'amplification génique par méthode LCx

 

1 - Principe

Dans son principe, ce test fait intervenir quatre sondes nucléotidiques qui reconnaissent une partie d'une séquence cible de l'ADN chromosomique des mycobactéries du complexe tuberculosis, sur laquelle elles se fixent de façon adjacente. La séquence reconnue code pour l'antigène b. Dans un premier temps, une DNA polymérase thermostable comble les espaces entre les amorces, ensuite une ligase également thermostable réunit les fragments les uns aux autres, l'amplicon est alors constitué. Il sera reconnu par deux sondes oligonucléotidiques, l'une permet la capture de l'hybride et le fixe dans le milieu réactif, l'autre permet ensuite la mise en évidence de la fixation par réaction immunoenzymatique.

 

2 - Mode opératoire

Se reférer à la fiche technique du kit du fabricant jointe en annexes du document.